ورود / ثبت نام
مقدمه
در آزمایشهای زیستشناسی مولکولی که با RNA سروکار دارند، بزرگترین دشمن محقق، آنزیمهای RNase هستند. این آنزیمها در همه جای محیط آزمایشگاه (روی دستکش، سطوح، حتی در هوای تنفسی) وجود دارند و میتوانند RNA شما را در چند ثانیه تخریب کنند. راه حل این مشکل، استفاده از RNase Inhibitor است.
RNase Inhibitor 50T به محصولی گفته میشود که حاوی 50 کیلوواحد (50,000 واحد) یا 50 واحد (در فرمولاسیونهای کوچکتر) بازدارنده آنزیم RNase میباشد. این محصول برای محافظت از RNA در واکنشهای حساس مانند RT-PCR، سنتز cDNA و ترجمه درون سلولی ضروری است.
RNase Inhibitor چیست و چرا به آن نیاز داریم؟
RNase (ریبونوکلئاز) آنزیمی است که به طور طبیعی در محیط وجود دارد و وظیفه تخریب مولکولهای RNA را بر عهده دارد. در حالی که این خاصیت برای سلولهای زنده مفید است، در آزمایشگاه یک فاجعه محسوب میشود.
RNase Inhibitor یک پروتئین نوترکیب (معمولاً با وزن مولکولی ۵۰ کیلودالتون) است که به طور اختصاصی به آنزیمهای RNase متصل شده و فعالیت آنها را به طور غیررقابتی مهار میکند .
مکانیسم عملکرد
مهارکنندههای RNase با تشکیل یک کمپلکس غیرکووالان با نسبت ۱:۱ به RNase متصل میشوند. این اتصال باعث پوشاندن جایگاه فعال آنزیم شده و از برخورد آن با مولکولهای RNA جلوگیری میکند .
مشخصات فنی RNase Inhibitor (مدل استاندارد ۵۰ کیلو دالتون)
محصولات مهارکننده RNase معمولاً از منابع مختلفی مانند موش (Murine) یا انسان تهیه میشوند. در جدول زیر مشخصات فنی یک نمونه استاندارد آورده شده است :
ویژگیمشخصاتوزن مولکولی۵۰ kDaمنبعنوترکیب موشی (Murine) – فاقد جفت سیستئین حساس به اکسیداسیونفعالیتمهار اختصاصی RNase A، B و Cدامنه pH فعال۵.۰ تا ۹.۰ (بهینه در ۷.۰ تا ۸.۰)پایداری اکسایشیبالا – پایدار در غلظتهای کم DTT (کمتر از ۱ میلیمولار)غیرفعالسازیدماهای بالاتر از ۶۵ درجه سانتیگراد یا شرایط دناتوره کننده قویکاربردهاRT-PCR، سنتز cDNA، رونویسی درون سلولی، برچسبگذاری RNA
تعریف واحد فعالیت
یک واحد از RNase Inhibitor، مقداری است که برای مهار ۵۰ درصد فعالیت ۵ نانوگرم آنزیم RNase A لازم است . محصولات 50T معمولاً حاوی هزاران واحد هستند (مثلاً ۵۰,۰۰۰ واحد).
مزایای استفاده از RNase Inhibitor نوترکیب موشی نسبت به نوع انسانی
مدلهای قدیمی مهارکننده RNase (نوع انسانی یا خوکی) دارای جفت سیستئینی هستند که به شدت در برابر اکسیداسیون حساس میباشند. این حساسیت باعث میشود که این مهارکنندهها در شرایط آزمایشگاهی (مانند محیطهای حاوی مواد اکسیدکننده) به سرعت غیرفعال شوند.
اما نوع نوترکیب موشی (Murine Recombinant RNase Inhibitor) با حذف این جفت سیستئین، مزایای زیر را دارد :
✅ مقاومت بالاتر در برابر اکسیداسیون – طول عمر بیشتر در واکنشهای طولانی.
✅ پایداری در غلظت پایین DTT – مناسب برای Real-time RT-PCR که DTT بالا به واکنش آسیب میزند.
✅ فعالیت مطلوب در محدوده pH وسیع – سازگاری با بافرهای مختلف.
✅ عدم مهار پلیمرازها – تداخلی با Taq DNA Polymerase، رونوشتبردارهای معکوس (AMV، M-MuLV) و RNA پلیمرازهای فاژی (SP6، T7، T3) ندارد .
کاربردهای اصلی RNase Inhibitor 50T
این محصول در طیف گستردهای از آزمایشهای مولکولی کاربرد دارد:
کاربردشرحRT-PCR و Real-time RT-PCRمحافظت از RNA در حین رونویسی معکوس و آمپلیفیکاسیونسنتز cDNAجلوگیری از تخریب RNA الگو قبل از سنتز رشته اولرونویسی درون سلولی (In vitro Transcription)افزایش بازده تولید RNA نوترکیبواکنشهای برچسبگذاری آنزیمی RNAحفظ یکپارچگی RNA در حین نشاندار کردنترجمه درون سلولی (In vitro Translation)افزایش پایداری mRNA در سیستمهای بدون سلول
نکات مهم در استفاده و نگهداری
برای حفظ فعالیت مهارکننده RNase، رعایت نکات زیر ضروری است:
۱. شرایط نگهداری
دمای نگهداری: منفی ۲۰ درجه سانتیگراد (-20°C). از چرخههای انجماد و ذوب مکرر (Freeze-Thaw) خودداری کنید .
آلیکوت کردن (Aliquoting): بهتر است محصول را در حجمهای کاری کوچک (مثلاً ۱۰ میکرولیتری) تقسیم کرده و منجمد کنید.
۲. غیرفعالسازی (Inactivation)
اگر بعد از واکنش نیاز به غیرفعال کردن مهارکننده دارید (مثلاً برای خالص سازی RNA)، کافی است نمونه را تا دمای بالای ۶۵ درجه سانتیگراد حرارت دهید .
۳. احتیاطات عمومی
همیشه روی یخ کار کنید.
از نوک پپت و لولههای عاری از RNase (RNase-free) استفاده کنید.
دستکش بپوشید و مرتباً تعویض کنید.
نحوه استفاده در آزمایش RT-PCR (دستورالعمل عمومی)
در یک واکنش RT-PCR معمولی، RNase Inhibitor به مخلوط واکنش اضافه میشود:
مخلوط مستر میکس حاوی بافر، dNTP، پرایمر و رونوشتبردار معکوس را آماده کنید.
RNase Inhibitor را با غلظت توصیه شده (معمولاً ۰.۵ تا ۱ واحد به ازای هر میکرولیتر واکنش) اضافه کنید.
RNA الگو را اضافه کرده و واکنش را طبق پروتکل دستگاه حرارتی آغاز کنید.
مهارکننده در دماهای بالای ۶۵ درجه طی مرحله دناتوراسیون اولیه غیرفعال خواهد شد.
نتیجهگیری
RNase Inhibitor 50T یک ابزار ضروری برای هر آزمایشگاهی است که با RNA کار میکند. انتخاب محصول با منشأ نوترکیب موشی (Murine) به دلیل مقاومت بالاتر در برابر اکسیداسیون و پایداری در غلظت پایین DTT، گزینهای برتر نسبت به انواع انسانی و خوکی میباشد.
با استفاده صحیح از این مهارکننده، میتوانید نتایج قابل اعتماد و تکراری در آزمایشهایی مانند RT-PCR، سنتز cDNA و رونویسی درون سلولی دریافت کنید.
توجه: این محصولات صرفاً برای مصارف تحقیقاتی (Research Use Only) بوده و در تشخیصهای بالینی کاربرد ندارند .
سوالات متداول
سوال ۱: آیا RNase Inhibitor از RNA در برابر همه RNaseها محافظت میکند؟
خیر. این مهارکننده فقط RNase A، B و C را مهار میکند و بر علیه RNase 1، RNase T1، S1 Nuclease و RNase H مؤثر نیست .
سوال ۲: آیا RNase Inhibitor با آنزیمهای پلیمراز تداخل دارد؟
خیر. این محصول به طور اختصاصی طراحی شده تا هیچ گونه مهار آنزیمهایی مانند Taq DNA Polymerase، رونوشتبردارهای معکوس (AMV، M-MuLV) و RNA پلیمرازها (SP6، T7، T3) نداشته باشد .
سوال ۳: تفاوت RNase Inhibitor معمولی با نوع Recombinant چیست؟
نوع Recombinant (نوترکیب) با مهندسی ژنتیک تولید میشود و فاقد مشکلات حساسیت به اکسیداسیون نسخه طبیعی است. پایداری بالاتری دارد و برای واکنشهای حساس مانند Real-time PCR مناسبتر است .
آیا به مشاوره برای خرید RNase Inhibitor مناسب برای آزمایش خود نیاز دارید؟ تماس بگیرید.